Laboratorium Genomiki (LG)

Laboratorium Genomiki wchodzące w skład CDT-CARD powstanie na bazie istniejącego obecnie Ośrodka Genomiki Medycznej OMICRON, który działa na Wydziale Lekarskim UJ CM od roku 2013.

Obecnie, oprócz podstawowego wyposażenia z biologii molekularnej, laboratorium to jest wyposażone w skaner mikromacierzy i sekwenatory nowej generacji. W chwili zakupu stanowiły one unikatowy w polskiej i środkowoeuropejskiej skali sprzęt, pozwalający na niezwykły na owe czasy wzrost przepustowości genotypowania i sekwencjonowania DNA oraz RNA.

Ośrodek jest wyposażony w następujące urządzenia badawcze:

  • sekwenatory następnej generacji – MiSeq (Illumina), GS Junior (Roche)
  • skaner mikromacierzy – HiScan (Illumina)
  • chromatograf cieczowy sprzęgnięty ze spektrometrem masowym – Velos PRO (Thermo Scientific)
  • system do elektroforezy dwuwymiarowej – Dodeca (BioRad)
  • PCR w czasie rzeczywistym – CFX384 (BioRad), CFX96 (BioRad), MiniOpticon (BioRad)
  • stacje do automatycznego przygotowywania reakcji (bioroboty) – Bravo Liquid Handling System (Agilent)
  • aparat do automatycznej izolacji kwasów nukleinowych – Maxwell 16 (Promega)
  • aparat do selecji fragmentów DNA – BluePippin (Sage Science)
  • Luminometr – Glomax (Promega)
  • zestaw do fragmentacji DNA – Bioruptor (Diagenode)
  • czytniki kodów kreskowych
  • niezbędny sprzęt do obróbki próbek w laboratorium biologii molekularnej stosującym standardy dobrej praktyki laboratoryjnej (DPL)

Przechowywanie próbek

  • zamrażarki -80°C
  • diuary na ciekły azot
  • system znakowania próbek kodami kreskowymi 2D

Analiza i przechowywanie danych

  • serwery NAS (Network Attached Storage) 20TB
  • serwery obliczeniowe
  • środowiska do wirtualizacji
  • prywatna chmura – OpenNebula
  • system kontenerowy – Docker.

Z jednej strony, sprzęt ten w dzisiejszym polskim krajobrazie naukowym i usługowym mocno spowszedniał – pojedyncze wówczas w Polsce sekwenatory nowej generacji dzisiaj są liczone w kraju w setkach egzemplarzy. Z drugiej strony – działanie laboratorium w zapewnionych przez uczelnię stabilnych warunkach finansowania oraz zatrudnienia – wiele osób zatrudnionych wówczas w laboratorium pracuje w nim do dzisiaj – pozwoliło zdobycie obszernego, wysokiej jakości know-how w dziedzinie genomiki przez niemałą jak na krajowe warunki (10 zatrudnionych aktualnie osób) grupę badaczy, co dokumentują liczne publikacje naukowe z afiliacją Ośrodka.

Dlatego zakup proponowanego sprzętu trafia na niezwykle podatny grunt, na który składają się oprócz wspomnianych kadry badawczej i know-how, także nawiązane kontakty badawcze na uczelni i poza nią oraz rozeznanie w aktualnych trendach naukowych i najczęściej zadawanych pytaniach naukowych.

Proponowane wyposażenie Laboratorium Genomiki w sprzęt do sekwencjonowania długich fragmentów kwasów nukleinowych, sekwencjonowania pojedynczych komórek oraz do genomiki funkcjonalnej stworzy w połączeniu z istniejącym sprzętem laboratorium unikatowe, gdyż pozwalające na realizację większości zadań badawczych z dziedziny genomiki, jakie są udziałem najlepiej wyposażonych laboratoriów światowych. W skali Europy Środkowej będzie to jeden z lepiej wyposażonych ośrodków genomiki.

Jedne z najciekawszych pytań naukowych, jakie stawia współczesna nauka są związane z heterogennością tkankową, definiowaną na poziomie molekularnym. Dotyczy to nie tylko kwestii oczywistych, jak występowanie różnych typów komórek w danej tkance, na przykład komórek nowotworowych obok zdrowego podścieliska, czy różnych typów limfocytów w węźle chłonnym, ale także heterogenności wśród komórek, które morfologicznie oraz na podstawie analizy wyróżniających je markerów były dotychczas uznawane za homogenne. Można wykazać przechodzenie jednych komórek w inne, wśród tych pozornie homogennych grup, można śledzić ich odpowiedź na bodźce środowiskowe i odpowiedź na leki.

Fascynującym na przykład jest analiza oporności komórek nowotworowych na leki, gdy okazuje się, że niewielka frakcja takich komórek może być od samego początku oporna na leki, z którymi nigdy wcześniej się nie zetknęła. Z czego ta oporność wynika? Czy jest efektem nagromadzonych przypadkowo mutacji w genomie takich komórek? A może szczególnej kombinacji genów ulegających ekspresji jedynie w części komórek? Znalezienie odpowiedzi na te pytania ma olbrzymie implikacje dla diagnostyki i dalszego leczenia tych pacjentów. Może dałoby się wykrywać istniejącą oporność na lek przeciwnowotworowy, który jest stosowany standardowo w danej sytuacji, zanim zostanie zastosowany na próżno u danego pacjenta? Może przeciwnie, dałoby się zastosować taki zestaw leków, aby zwalczyć wszystkie oporne komórki nowotworowe? Albo monitorować sytuację na bieżąco i zmieniać leki w miarę pojawiania się większego odsetka komórek opornych i w ten sposób utrzymywać chorobę pod kontrolą przez długi czas? Odpowiedzi na te pytania można szukać tylko, albo przynajmniej rzec można lepiej, gdy mamy odpowiednią rozdzielczość w obserwacji nowotworu. Najlepiej jeśli jest to rozdzielczość na poziomie pojedynczych komórek.

Warto dodać, że podobne pytania, mające rozwiązanie w heterogenności badanych komórek, można stawiać także poza obszarem chorób nowotworowych, np. w immunologii i leczeniu chorób z autoagresji, gdzie genomika pojedynczych komórek pozwala znaleźć nie spodziewane wcześniej frakcje komórkowe, których istnienia nie podejrzewano. Sprzęt do genomiki pojedynczych komórek pozwala na unikalne spojrzenie na tak zarysowane problemy.

O ile genomika pojedynczych komórek wydaje się mieć najbardziej bezpośrednie, unikalne zastosowania w chorobach nowotworowych i immunologii, to sprzęt umożliwiający odczyt długich fragmentów kwasów nukleinowych wydaje się mieć najbardziej unikatowe zastosowania w metagenomice oraz także w genomice nowotworowej.

Od pewnego czasu można badać ślady pozostawiane przez bakterie w postaci ich kwasów nukleinowych, które znajdujemy nawet w pozornie jałowych miejscach. W tym celu stosowana jest technika sekwencjonowania genów kodujących tzw. 16S rybosomalne RNA.

W tym celu wystarczające są krótkie odczyty, takie jak dostępne dla sekwenatora Miseq, a sama technika jest znana i stosowana od lat w Ośrodku. Jednak poza stwierdzeniem obecności jakiegoś szczepu bakteryjnego można z jego genomu wysnuć dużo więcej informacji, np. jak ewoluował w trakcie zakażania kolejnych osób albo czy posiada geny odporności na antybiotyki. Analogicznie do sytuacji z komórkami nowotworowymi, poprzez sekwencjonowanie całych genomów mikroorganizmów możliwe jest wykrycie odporności na leki, zanim niepotrzebnie dany antybiotyk zostanie zastosowany. Genomy bakteryjne są jednak trudne w sekwencjonowaniu i analizie. Wynika to z faktu, że dopasowanie fragmentów w unikalny sposób tak, aby uzyskać pełny obraz genomu jest komputerowo (w przypadku krótkich odczytów) bardzo żmudne i mało dokładne, szczególnie w nierzadkiej sytuacji, gdy nie dysponujemy nawet przybliżonym genomem referencyjnym. W przypadku zastosowania unikalnej metody odczytu długich fragmentów kwasów nukleinowych z komórek nowotworowych, uzyskujemy możliwość wglądu w zmiany genetyczne, inne niż dominujące do dziś w analizach, łatwiejsze do oceny polimorfizmy pojedynczych zasad. Dzięki tej technice możemy łatwiej dopasować do siebie fragmenty genomu, które zostały porwane na fragmenty poprzez duże mutacje.

Wreszcie, dysponując już kilkuletnim doświadczeniem w pracy w obszarze genomiki, można podać liczne przykłady, gdy znaleziona mutacja nie została potwierdzona badaniami funkcjonalnymi. Informacja o tym, że mutacja ma znaczenie funkcjonalne, w istotny sposób zwiększa szanse, że nasze wnioskowanie odnośnie związku przyczynowo – skutkowego między zmianą genetyczną, a chorobą jest poprawne. W przypadku badań funkcjonalnych sytuacja jest o tyle trudniejsza, że nie ma – w przeciwieństwie do sekwencjonowania nowej generacji – jednej metody pozwalającej zrealizować te badania. Pojedyncza mutacja moźe bowiem wpływać na ekspresję genu, procesy regulacyjne w szeroko pojętym metabolizmie komórek, ich szybkość proliferacji i wiele innych aspektów. Dlatego dobór sprzętu do badań funkcjonalnych jest dużo trudniejszy niż wybór odpowiedniego sekwenatora.

Niezbędne jest usprawnienie prowadzonych w Ośrodku Genomiki badań funkcjonalnych w dwóch konkretnych aspektach:

  • umożliwienie użycia unikalnej metody nukleofekcji, najbardziej wydajnego sposobu elektroporacji komórek w celu wprowadzenia do nich materiału genetycznego, na przykład zawierającego badaną mutację oraz
  • umożliwienie precyzyjnego badania wpływu mutacji na metabolizm komórkowy. Jest to bowiem bardzo ważny aspekt funkcjonowania komórek, który można dalej badać przy pomocy posiadanego już sprzętu (np. czytnika chemiluminescencji).

Warto wspomnieć, że wnioskowana dla Laboratorium Genomiki aparatura nie tylko jest unikalna sama w sobie i tworzy znakomite środowisko do prowadzenia badań naukowych w tym laboratorium, ale także może być wykorzystana synergicznie ze sprzętem mającym stać się wyposażeniem innych laboratoriów. Wystarczy wspomnieć, że zmiany zapoczątkowane na poziomie genomu nie zawsze będą w chwili badania widoczne np. na poziomie transkryptomu czy metabolizmu komórkowego. Bardzo pomocne będzie unikalne połączenie możliwości badawczych i wspólne wykorzystanie także metod analizy proteomu, jak spektrometria masowa oraz sortowania komórkowego, dla których sprzęt jest wnioskowany dla sąsiednich laboratoriów.