Centrum Rozwoju Terapii Chorób Cywilizacyjnych i Związanych z Wiekiem

Możliwości badawcze

Zestawienie możliwości badawczych Laboratorium Badań Izotopowych i Analiz Funkcjonalnych CDT-CARD

W zakresie selekcji kandydatów na lek w przedklinicznej metodyce badań in vitro:

  • badania powinowactwa nowych struktur (związków) do określonego celu biologicznego
    (tj.; receptory sprzężone z białkiem G, kanały jonowe, receptory jądrowe, transportery błonowe) za pomocą metod radioreceptorowych lub z użyciem ligandów fluorescencyjnych – badania skriningowe i dokładna charakterystyka z wyznaczeniem wartości Ki, IC50

Przykłady:

  • Receptory serotoninowe 5-HT1A, 5-HT2A, 5-HT2C, 5-HT6, 5-HT7,
  • Receptory dopaminowe D1, D2, D3,
  • Receptory histaminowe H1, H3, H4,
  • Receptory kannabinoidowe CB1 i CB2
  • Receptor muskarynowy M1
  • Receptory opioidowe mu, delta, kappa
  • Transportery dla monoamin (SERT, DAT, NET),
  • Receptory adrenergiczne (α1, α2, β)
  • Receptory GABAergiczne GABA-A, GABA-B, BZD,
  • Receptory glutaminergiczne (AMPA, NMDA, miejsce MK-801, miejsce glicynowe, mGluR)
  • Kanały sodowe (VGSC)
  • określanie parametrów kinetyki wiązania dla związków względem wybranego receptora – za pomocą metod radioreceptorowych, z wyznaczeniem wartości kon/Koff i Kd
  • określenie zmian gęstości błonowej receptorów pod wpływem badanych związków (oznaczenia in vitro i ex vivo) z wyznaczeniem wartości Bmax i Kd
  • określenie rodzaju modulacji allosterycznej dla związków (metody radioreceptorowe, badania elektrofizjologiczne in vitro) – badania skriningowe i dokładna charakterystyka z wyznaczeniem wartości EC50/IC50
  • ocena wpływu związków na aktywność funkcjonalną transporterów komórkowych (np. SERT, DAT, NET) z zastosowaniem metod izotopowych i scyntylatorów w fazy stałej
  • określenie aktywacji/hamowania kanałów jonowych za pomocą funkcjonalnych metod elektrofizjologicznych oraz alternatywnych metod fluorescencyjnych

Przykłady:

  • hERG (Kv11.1),
  • GABAA (α1β2γ2),
  • GIRK
  • oznaczenia aktywności inhibitorów enzymatycznych (fosfatazy, fosfodiesterazy, monoaminoaksydazy, kinazy, np. Cdk5) z użyciem preparatów enzymów rekombinowanych
  • badania procesów transdukcji sygnału w ocenie aktywności funkcjonalnej ligandów receptorów (m.in.: określenie aktywności wewnętrznej ligandów GPCR i potencjalnej selektywności funkcjonalnej w oparciu o aktywację wybranych szlaków sygnałowych w komórce)

Wykorzystanie homogennych, ultraczułych metod z detekcją w technologii AlphaScreen, AlphaLISA, FRET, TR-FRET, z detekcją fluorescencji, luminescencji lub techniki obrazowania komórek (HCS, cytometr) w badaniu różnych ścieżek sygnałowych takich jak np.:

  • PI3K/Akt/mTOR: 4E-BP1, Akt, BAD, c-Myc, GSK-3ß, m-TOR, p70S6K, PDGF, S6RP, SHP-1, SHP-2
  • JAK/JAK2/STAT: c-MYC, STAT1-STAT6
  • NFκB/TBK1: IKKα, NFκB p65, PKC μ, TBK1
  • MAPK: ATF-1, ATF-2, c-MYC, ERK 1/2, JNK 1/2/3, MEK1, p38 MAPK, Raf1
  • TGFß/BMP/SMAD: c-MYC, SMAD1-SMAD3
  • AC: cAMP
  • β-arestyna

Przykłady:

  • Receptory serotoninowe:
  • 5-HT1A (cAMP, Ca2+, ERK1/2, β-arestyna, GTPγ[S35])
  • 5-HT2A (Ca2+, cAMP)
  • 5-HT6 (Ca2+, cAMP, ERK1/2)
  • 5-HT7 (cAMP)
  •  Receptory dopaminowe:
  • D1 (cAMP),
  • D2 (Ca2+, cAMP, ERK1/2, β-arestyna )
    • Receptory Histaminowe:
  • H3 (cAMP, ERK1/2),
  • H4 (Ca2+, β-arestyna)
  • Receptor opioidowy:
  • mi (μ) (β-arestyna, ERK 1/2, cAMP, Ca2+)
  • Receptory adrenergiczne (cAMP, Ca2+)
  • Receptory adenozynowe (cAMP)
  • Receptor muskarynowy (Ca2+)
  • poszerzona charakterystyka farmakologiczna nowych połączeń na poziomie in vitro i ex vivo
    w zakresie oceny właściwości neuroprotekcyjnych, antyoksydacyjnych, przeciwzapalnych
    i przeciwnowotworowych.

Badanie oddziaływania nowych związków i materiałów na fenotyp komórek w modelach hodowli pierwotnych (zróżnicowane pluripotencjalne komórki macierzyste o charakterze neuronów lub kardiomiocytów, hepatocyty mysie i ludzkie, fibroblasty ludzkie, embrionalne fibroblasty mysie) lub unieśmiertelnionych linii komórkowych (kolekcja kilkunastu linii ciągłych, m.in. komórki HepG2, PC3, PC-12, SH-SY5Y, IMR-32, MCF-7, Caco-2, Jurkat, HeLa, Neuro-2a, RAW 264.7, Caco-2, HL-1, HL-60)

 

Między innymi, badanie wpływu związków i innych materiałów na:

  • wzrost neurytów (neuron outgrowth) za pomocą obrazowania komórek
  • poziom ekspresji genów z użyciem reakcji PCR w czasie rzeczywistym
  • procesy apoptozy (m.in.: oznaczanie kaspazy 3/7 i 8/9, aneksyny, test TUNEL)
  • poziom markerów antyoksydacyjnych (ROS, potencjał mitochondrialny)
  • ekspresję białkowych markerów wewnątrzkomórkowych i zewnątrzkomórkowych (np. markery zapalne, produkcja cytokin)
  • migrację komórek,
  • właściwości fagocytarne,
  • różnicowanie komórek
  • oznaczenie profilu bezpieczeństwa nowych połączeń, m.in.: test mutagenności Amesa oraz wieloparametrowe oznaczanie cytotoksyczności związków względem panelu linii komórkowych oraz komórek pierwotnych w celu oceny aktywności neurotoksycznej, kardiotoksycznej
    i hepatototoksycznej obejmujące oznaczenia:
  • proliferacji i morfologii komórek (test MTS, PrestoBlue)
  • wewnątrzkomórkowej akumulacji fosfolipidów i lipidów będacej markerem fosfolipidozy (LipidTOX stains)
  • funkcji mitochondriów związanej z toksycznością leków (depolaryzacja wewnętrznej błony mitochondrialnej, MitoTracker)
  • uszkodzeń błony komórkowej (test LDH, barwienie kalceiną-AM
  • wykorzystanie kultur organotypowych w badaniach procesów neurodegeneracji
    i neurotoksyczności oraz potencjalnej aktywności p/nowotworowej
  • uzyskiwanie nadekspresji białek rekombinowanych w komórkach eukariotycznych
    i prokariotycznych
Accessibility by WAH